一文帮你搞掂circRNA过表达!

发布时间:2024-05-31        浏览量:[ 203 ]


circRNA简介


自2012年circRNA分子在人体中发现大量存在,再到2022年circRNA用于开发抵抗新冠病毒疫苗研究的发表,circRNA的机制和应用研究一直红红火火至今。得益于高通量测序技术、生物信息学及表观遗传学研究技术的发展,circRNA的相关研究结果也呈爆发式增长。研究表明,circRNA与多种疾病的发生发展有关,为多种疾病的潜在治疗靶点和诊断标志物。


环状RNA(circRNA)是由前体RNA通过剪切,然后由线性RNA的头对尾连接形成,无5'-端帽子和3'-端poly (A)尾巴,由共价键相连的环状单链RNA。天然circRNA在生物体内的功能主要有:miRNA海绵、蛋白互作的支架、调控转录或翻译、翻译蛋白等。此外,还有大量circRNA有待发现或研究,大量circRNA的功能和作用机制有待阐明。



circRNA的生物学功能及应用[1]


circRNA的研究思路




由此可见,circRNA研究往往需要通过过表达和干扰目的基因,研究其功能或机制。也就是在细胞或生物体内人为地上调或下调目的基因的表达,从而研究目的基因的表达改变导致的影响。那么,如何对circRNA进行过表达呢?


circRNA过表达工具的选择


1、过表达质粒


基因工程上所用的质粒是一类能自我复制的DNA分子,其中一段DNA被切除而不影响载体复制,可以置换或插入外源目的DNA。构建含目的基因的质粒,通过化学法(如脂质体包裹)、物理法(如电穿孔)等转染细胞,将外源基因带入宿主细胞。质粒载体用于细胞的瞬时转染,导入的外源基因不会整合到宿主细胞基因组,只会短暂存在于宿主细胞核和细胞质中,表达目的基因。质粒载体作为circRNA过表达工具,具有方便快捷、灵活、制备周期短、成本低等优点。


circRNA过表达质粒载体一般有以下组成元件

1、复制起点(Ori):控制着质粒的复制,并决定了质粒的宿主属性和拷贝数;

2、启动子:是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列;

2、筛选标记:多为抗性基因,以便加以检测筛选;

3、多克隆位点区:质粒中内切酶集中的部分,即外源基因的插入位点,一般位于转录启动和转录终止信号之间;

4、其他元件:转录调控元件如增强子和蛋白标签如GFP等;

5、成环元件:因为circRNA的环状结构特性,其过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体来进行。CircRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列(RCMs,如Alu元件)或与能调控circRNA生成的蛋白(如QKI)的结合位点,因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列,质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链,再依靠长下游的反向互补配对促使成环。但这样选取的成环元件常导致成环效率低、准确性低、表达效率低等问题,往往需要多次验证摸索最佳的成环元件。使用商业化有通用成环框架的circRNA表达载体进行构建更便利和准确,只需要连接circRNA序列进入载体即可。



吉赛生物GENESEED® pCD25-ciR(GFP)质粒载体图谱


2、慢病毒过表达


慢病毒(letivirus)是一种逆转录病毒,需要相对较长的孵育时间,因此称为“慢”病毒。慢病毒载体来源于HIV-1,基因组包含2条正义链的RNA。慢病毒载体系统通常由穿梭质粒和辅助质粒组成:穿梭质粒携带目的基因、启动子等;辅助质粒载有表达衣壳、包膜等组成病毒骨架的基因,协助组装包含目的基因的病毒。慢病毒载体系统转染工具细胞,利用工具细胞组装和生产慢病毒的假病毒颗粒,将包装了外源基因的慢病毒感染细胞,能把外源基因整合到宿主基因组,实现长期稳定的表达。病毒载体转染效率高,常用于动物模型或稳转细胞株构建。



慢病毒包装示意图


3、腺相关病毒过表达


腺相关病毒(Adeno-associated virus)属于细小病毒科,Dependoparvovirus属,是一类无包膜的单链DNA缺陷型病毒,其生命周期依赖于复制病毒的参与,如腺病毒。野生腺相关病毒的基因组可以定点整合到人类19号染色体的AAVS1位点,而人工改造的重组腺相关病毒缺少整合和复制必要的两个基因,因此无法整合。用于基因工程的腺相关病毒携带的目的基因主要以游离https://www.geneseed.com.cn/于染色体的附加体形式存在,并可长时间存在于非分裂细胞中。利用穿梭载体和辅助载体,在工具细胞中组装含目的基因的腺病毒颗粒,通过感染细胞或注射动物体内,能实现目的基因的过表达。




在小鼠体内注射腺相关病毒(AAV)递送的环形RNA适配体,能够安全且有效抑制过度激活的蛋白激酶R(PKR),进而减少神经炎症和β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块,实现对阿尔茨海默病小鼠的神经保护、增强其空间学习和记忆能力。[2]




质粒载体助你找到The chosen one!


就circRNA研究而言,功能验证阶段,由于未明确研究的circRNA,有变更研究基因的风险,可以先使用质粒载体进行瞬转过表达。因为质粒载体相比其他方法更容易更换序列,更方便构建新的载体。


慢病毒构稳株助你深入研究!


明确了研究的主角circRNA之后,可利用慢病毒载体构建过表达circRNA稳转细胞株,进行circRNA的机制研究。稳转细胞株扩培和传代后仍可稳定过表达circRNA,不需要每次过表达都重新转染质粒,可谓是一劳永逸,一本万利!在肿瘤相关的研究中,还可以用过表达circRNA的稳转细胞株构建肿瘤模型,验证circRNA表达量上调对肿瘤发生发展的影响。


AAV助你完成更具靶向性的体内研究!


腺相关病毒(AAV)载体特异性强,不同血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力,配合适合的注射方法和合理的效力检测方法,可获得更好的实验数据。通过 AAV载体介导circRNA表达上调进行体内动物实验研究,能进一步探索circRNA与疾病发生发展的关系,为临床前和临床阶段的研究提供数据支持。


病毒助你解决转染难问题!


某些细胞无论用化学法还是物理法都难以转染质粒,就可以通过生物转染法,即利用病毒感染导入目的基因,提高转染效率。


载体构建流程



吉赛生物过表达载体


circRNA由于环形结构的特殊性在表达载体构建过程中,如果没有优化过侧翼成环框架则很容易出现不能成环或成环效率不高的问题,还会导致插入缺失碱基等情况出现。吉赛生物经过多年的迭代优化,设计的环化介导框架,能保证插入的目的circRNA片段正确环化,并高效表达。


吉赛生物研发的第五代RNA过表达载体可对mRNA/lncRNA/circRNA分子实现精准表达,能满足普通真核表达、慢病毒包装和腺相关病毒(AAV)包装等多种用途。其中circRNA载体均携带优化过的侧翼成环框架,含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的结合位点,并使用全新设计的环化介导序列,使插入的circRNA准确高效环化,mRNA及lncRNA表达载体携带强启动子及KOZAK序列,使mRNA/lncRNA精准正确表达。


吉赛生物作为国内开创circRNA载体构建领先者,circRNA过表达载体产品引用文章引用量接近700篇。此外,吉赛生物提供载体构建及慢病毒、腺病毒包装服务,助力科研人员轻松过表达RNA!


吉赛生物过表达载体信息


参考文献


[1] Liu CX, Chen LL. Circular RNAs: Characterization, cellular roles, and applications. Cell. 2022. doi: 10.1016/j.cell.2022.04.021.

[2] Xin Feng, Bo-Wen Jiang, Si-Nan Zhai, Chu-Xiao Liu, Hao Wu, Bang-Qi Zhu, Meng-Yuan Wei, Jia Wei, Li Yang, Ling-Ling Chen. Circular RNA aptamers ameliorate AD-relevant phenotypes by targeting PKR. BioRxiv. 2024.  doi: https://doi.org/10.1101/2024.03.27.583257