测序早已进入Next level——Nanopore三代测序，你了解吗？

从上世纪70年代突破性的一代测序发展至二代测序技术，通量和效率都有了跨越式的提升。二代测序技术改进使其成本逐渐降低，通量和精度逐渐提高，深受分子生物学研究者们的青睐。然而，二代测序技术一般需将核酸链打碎和PCR扩增，难以避免扩增过程的偏差和错配，测序后的序列组装过程也可能丢失相当一部分信息。因此，在面对高度重复、高GC含量、拷贝数变异、结构复杂等序列时，显得有些捉襟见肘。

就如移动通讯从2G飞速发展到如今的5G，测序技术快速发展和优化，二代测序技术问世几年后，三代测序技术如雨后春笋般争先出现，备受瞩目。第三代测序技术是指单分子实时测序技术，也被称为从头测序技术。其中，英国牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）开发的纳米孔（Nanopore）测序技术是目前三代测序的中流砥柱。

Nanopore三代测序设备

Nanopore 三代测序设备主要为含有一系列纳米孔蛋白的流动槽芯片，纳米孔蛋白嵌在一层电阻膜中，每个纳米孔有对应的电极，电极与通道和传感器芯片相连，传感器芯片可以测量流过纳米孔的电流。

图1. Nanopore 三代测序设备[1]

纳米孔蛋白（Nanopore）

自然界中某些嵌入细胞膜中的蛋白可作为离子或分子通道，这些跨膜蛋白具有天然的蛋白纳米孔（Nanopore）。跨膜蛋白经基因工程改造后，得到测序所需的Nanopore蛋白。Nanopore蛋白具有超微小孔，仅允许单个核酸聚合物（单链的DNA或RNA）通过。

图2. Nanopore蛋白结构[2]

电阻膜（electro-resistant membrane）

一种高电阻的人工合成多聚物膜，Nanopore蛋白嵌入电阻膜到上，膜两侧是离子溶液，在膜两侧施加不同的电位，使离子在纳米孔中流动，可形成电流，核酸通过纳米孔时，会影响膜上的电流。

图3. 嵌有Nanopore蛋白的电阻膜[3]

动力蛋白（Motor）

Nanopore三代测序文库构建过程中，每条核酸链的接头（Adapter）处都会连接一种动力蛋白，动力蛋白能牵引核酸穿过纳米孔。

图4. Nanopore三代测序文库构建后，核酸链末端结构示意图[1]

锚定结构（Tether）

每个纳米孔蛋白周围有Tether分布，在测序过程中，Tether发挥锚定作用，结合核酸分子的接头，把核酸分子捕捉到纳米孔蛋白附近，确保核酸分子能准确进入纳米孔，防止其在溶液中移动。

图5. Nanopore三代测序核心组件示意图[1]

微阵列支架（Array of microscaffolds）

每个微阵列支架支撑着一层膜和嵌入的纳米孔，用于维持纳米孔在运输和使用过程中的稳定。

图6. 微阵列支架[1]

传感器芯片（Sensor chip）

每个微支架对应于各自的电极，该电极与传感器芯片中的通道相连。

集成电路传感器（ASIC）

每个纳米孔通道由ASIC控制，并由定制的ASIC单独测量，使多个纳米孔可同时测量。

图7. Nanopore三代测序设备示意图[4]

Nanopore 三代测序原理

Nanopore三代测序文库构建时，在待测DNA或RNA链引入接头序列，加入Motor。Nanopore测序设备中的电解液室被施加电压，产生穿过孔的稳态离子电流。待测DNA或RNA上样后，样品在流动槽芯片上进行布朗扩散，Tether将DNA或RNA锚定在纳米孔蛋白处。Motor蛋白将DNA链解开成单链，同时推动DNA或RNA通过纳米孔。当一个分子通过纳米孔时，离子电流就会被打断，引起电流波动。一条DNA或RNA链由四种核苷酸碱基的不同组合序列组成：A、T(或RNA的U)、G和C，根据每一种碱基通过纳米孔造成的特征电流波动信号，使用碱基调用算法进行解码，可以识别不同的碱基，实时确定DNA或RNA序列。

图8. Nanopore三代测序技术文库构建过程[4]

ONT官网的介绍把通过纳米孔的电流比作流经管道的水，当一个物体进入管道，水流就会被打断，就像DNA在通过纳米孔时打断电流一样。而脑洞一直很大的小编认为Nanopore测序过程像一条过安检的队伍。队伍（核酸）会被附近的指示牌（Tether）招呼到安检口（Nanopore），安检人员（Motor）在安检口附近催促队伍前进，还会把并排的两条队伍（DNA）拆成单条队伍，安检口可以检测到通过每个人（碱基）的情况。

图9. Nanopore三代测序过程[5]

Nanopore三代测序的优势

① 长读长：可直接测定读长达数Mb，能全面识别结构复杂和高度重复区域序列，高分辨率表征可变剪接等，避免了二代测序的复杂算法分析及其导致的信息遗漏；

② 高准确性：不需PCR扩增测序，避免了扩增过程造成的偏差和错配；保留了原始碱基修饰信息，能直接读出碱基的修饰。

③ 操作便捷：简化了测序和样品制备过程，经过清洗可重复使用芯片，节约时间，降低成本；

④ 灵活性高：每个样品可使用独立芯片处理，无需批量样品上机；

⑤ 可实时测序：每个纳米孔在极短时间内完成一个分子的测序，且在生成数据时便可立即分析结果，产生的足够的数据即可停止测序。

Nanopore三代测序的应用

1. Nanopore全基因组测序

全基因组测序旨在提供对生物体基因组的完整分析，在识别人类、植物和动物与疾病或特征性状有关的新变异以及分析微生物种群爆发等研究领域发挥重要作用。

技术优势：

① 能提供更长的连续序列信息、更明确的序列组装；

② 无需PCR测序，能准确分辨结构变异、重复区域、多位点杂合和融合基因，还能表征基因组的碱基修饰。

2. Nanopore全长转录组测序

RNA测序可以分析目标生物体中的RNA转录本，从而分析其基因的表达、生物活性概况等。根据得到的明确转录组，可进行发育生物学、癌症等疾病的机制、确定潜在的疾病生物标志物、RNA病毒基因组等研究。Nanopore技术分析转录组，可选择cDNA测序，也可选择天然RNA直接测序。

（1）Nanopore Direct RNA测序

Nanopore Direct RNA测序指对天然RNA进行测序，是对单个RNA分子进行单分子水平的全长测序。

技术优势

① 无需PCR，无GC偏好性，提供无偏全长且链特异的RNA序列；

② 准确检测poly(A)尾长度，为RNA稳定性和翻译效率等转录后调控研究提供帮助；

③ 直接识别RNA碱基修饰信号实现转录和表观信息的一举多得。

图10. Nanopore Direct RNA测序流程图[6]

（2）Nanopore cDNA-PCR测序

对RNA进行逆转录及PCR扩增后，进行Nanopore三代测序。

技术优势

① 可获得全长转录本序列，对片段大小无偏好，无需边合成边测序，GC偏好性远低于二代测序平台；

② 无需拼接，在可变剪接、融合基因、APA、新基因预测等转录本层面的结构变异检测方面具有绝对优势；

③ 可实现转录本（mRNA或polyA+ lncRNA）表达水平准确定量；

④ 相比Direct RNA测序，cDNA较稳定，提高了数据质量；对于RNA含量较少的样本，Nanopore cDNA-PCR测序经PCR扩增，检出率更高，通量更高。

图11. Nanopore cDNA-PCR测序流程图

（3）Nanopore circRNA全长测序

利用随机引物对富集后的circRNA进行滚环反转录扩增，采用纳米孔测序技术对circRNA的全长序列进行直接测序，并使用特定算法，实现对长测序片段中的circRNA序列进行识别和全长重构。

技术优势

① 更强的检出率：circRNA reads检测效率相比二代测序提高20倍以上。

② 更高的灵敏度：可识别低丰度的circRNA，能够更敏感地捕获到非经典circRNA，i.e., intronic。

③ 更多更准确的应用领域：

· 准确识别可变剪切事件；

· 直接识别癌症等重大疾病的重要生物标志物——融合环状RNA（f-circRNA）；

· 能够更敏感的识别研究热点——线粒体环状RNA。

图12. circRNA全长纳米孔测序技术路线

3. Nanopore宏基因组测序

宏基因组学是对单个样本中的多种生物体进行基因组分析，揭示了对微生物群落遗传组成的信息。Nanopore三代测序可提供更精准的基因组组装，对信息基因进行全长测序，例如 16S 核糖体基因。利用特定的16S引物对特定环境中的微生物16S rDNA全长进行扩增测序，以研究微生物群落组成、物种丰度以及样本间群落组成差异情况。

技术优势

① 可实现全长16S rDNA的测序，获取更多的高可变区信息，提高物种注释的分辨率和准确性；

② 可全面准确地展现微生物群落结构。

图13. Nanopore 16S rDNA扩增子测序流程图

吉赛生物已建立完备的Nanopore三代测序平台，可提供专业的Nanopore Direct RNA测序、Nanopore cDNA-PCR测序、Nanopore circRNA全长测序、Nanopore 16S rDNA扩增子测序等技术服务，助力更精准更深入的分子生物学研究！

参考资料

[1] https://www.youtube.com/watch?v=RcP85JHLmnI

[2] https://www.youtube.com/watch?v=sv9fFeSd3kE

[3] https://www.youtube.com/watch?v=E9-Rm5AoZGw&t=13s

[4] Wang Y, Zhao Y, Bollas A, Wang Y, Au KF. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nat Biotechnol. 2021 Nov;39(11):1348-1365.

[5] https://nanoporetech.com/platform/technology

[6] Workman R E, Tang A D, Tang P S, et al. Nanopore native RNA sequencing of a human poly (A) transcriptome[J]. Nature methods, 2019: 1-9.