如何战胜细胞实验的“无形杀手”——支原体?

发布时间:2024-07-03        浏览量:[ 104 ]


知己知彼百战百胜!

先了解支原体是个什么东西?


支原体(Mycoplasma)是一种没有细胞壁、能独立生存的原核生物,大小约0.1-0.3μm,介于细菌和病毒之间。细胞培养物中最常见支原体的有猪鼻支原体(M. hyorhinis)、口腔支原体(M. orale)、精氨酸支原体(M. Arginini)和莱氏无胆甾原体(A. laidlawii)。此外还有20多种能污染细胞的支原体,有的细胞株甚至能同时污染多种支原体。前段时间流行的肺炎支原体是致病性的,但大多数支原体不致病。



M. Mycoides(一种常见的污染细胞培养物的支原体)模型图[1]


是谁引入了支原体?


① 细胞培养人员的口腔、皮肤等;


② 细胞培养操作环境或实验器材;


③ 培养基,如胎牛血清和新生牛血清可能带有精氨酸支原体和莱氏无胆甾原体,猪来源的胰酶可能存在猪鼻支原体等。


④ 外来细胞株,特别是原代细胞。


支原体杀伤力有多强?


① 影响细胞生长和代谢


支原体消耗营养物质,增加代谢废物,导致pH改变,促进或抑制细胞因子表达,可能导致染色体畸变,影响细胞的形态和生长特性、免疫和代谢机制等。


② 增加细胞碎片


支原体使培养体系中的细胞碎片增加,影响细胞的附着、贴壁、增殖,需频繁换液。


③ 交叉感染


支原体能迅速繁殖,很快又“见缝插针”入侵到其它培养体系中,导致污染不断扩大。


④ 严重影响实验结果


支原体不仅影响细胞的遗传代谢途径,改变细胞原本的生物学特性,还会直接引入DNA、RNA、蛋白及其它代谢物的污染,影响实验的准确性及可重复性,甚至会得到相反的研究结论。


尤其在高通量测序研究中,支原体污染影响极大。支原体基因组小,但编码基因数量较多,直接带来的核酸污染,其基因表达可能与培养的细胞存在一定相似性,出现一些难以解释的基因表达信号,给结果解读带来困难;支原体带来的核酸污染占据相当一部分测序数据量,干扰目标细胞数据的获取,导致目标数据量不足。因此,开始实验前一定先确保细胞没有支原体污染啊!不然就功亏一篑了。


支原体有多难对付?


①(能见缝插针、突破防线!)支原体细胞小,可通过220纳米孔的除菌过滤器滤膜;


②(会易容术啊!)支原体形态多变,难以用显微镜观察或鉴定;


③(常规毒对它无效!)支原体对靶向细胞壁合成的抗生素无反应;


④(无声息地扰乱局势)支原体感染丰度可达10^8个/mL,而不引起明显浑浊,可能对细胞生长无明显影响,甚至可能在短时间内促进细胞增殖(别问我怎么知道的o(╥﹏╥)o)。


⑤(隐忍的潜伏策略)支原体可能维持较低水平污染,灵敏度较低的方法很难检测到。

那么,怎么设防避免支原体污染?


① 检测新样品或试剂,如细胞、培养基、血清等,试剂分装使用。


② 定期检测培养中的细胞,及时发现及时处理。


③ 规范无菌操作;正确消毒灭菌;感冒咳嗽尽量不进入细胞房,如必要,在操作后彻底将使用空间灭菌消毒;


④ 适量使用针对支原体的抗生素,但用量尽量少,避免支原体产生耐药性。


出什么招才能打赢支原体?


第一步:监察敌情


怀疑支原体感染的细胞状态:细胞增殖减缓慢;状态变差;边界模糊;形态异常,但上清液清澈;背景干净且换液后无改善。


准确检测支原体污染:单凭观察难以确定支原体污染,需要用更精准的检测方法。就算没有怀疑对象,也应该定期检测培养的细胞。目前已开发了微生物培养法、DNA荧光染色、ELISA等多种支原体检测方法,其中省时省力省心又精准的方法要数Taqman qPCR法。



固体培养基上典型的支原体菌落,具有“煎蛋”形态[2]


使用试剂盒检测最便捷稳妥!吉赛生物支原体检测试剂盒GSDetect® Taqman Mycoplasma Detection Kit(UNG plus),配套了基于 Taqman qPCR 法检测支原体的相关试剂,包括针对支原体 16S rRNA 的保守区域序列设计的特异性引物和荧光探针(FAM 标记)。使用试剂盒可直接以细胞培养上清或血清等生物材料为模板,进行qPCR即可精准检测常见的 16 种支原体。试剂盒内添加 dUTP/UNG 酶体系,能避免 PCR 产物气溶胶污染导致的假阳性,大幅提高检测的准确性。


第二步:正面交锋


①(划分禁区)及时将支原体污染的细胞隔离处理。


②(初步清除)多次洗涤细胞和低速离心换液,去除上清中较小的支原体,使细胞培养体系中的支原体数量降至最低。


③(对症下药)利用支原体敏感的抗生素进行抑杀。支原体无细胞壁,对内酰胺类、万古霉素等抗生素不敏感,可使用大环内脂、四环素和喹诺酮三类抗生素目前公认对抗支原体效果较好的药物,也可使用其它支原体清除剂,或支原体清除培养基。


知己知彼,而后见招拆招,这样就再也不用担心支原体污染细胞影响实验结果啦~~


吉赛生物Taqman探针法支原体检测试剂盒

(UNG防污染版)

产品特点


① 操作简便,直接使用1μL细胞培养上清或血清进行检测,无需提取DNA。


② 检测灵敏度高,准确率高,耐受青霉素和链霉素或其他抑制物的影响。


③ 特异性强,只能扩增支原体DNA,不会扩增细菌真菌或真核细胞的DNA。


④ 检测快速,最快1小时即可判定结果。


试剂盒可检测的支原体类型



*:培养细胞中污染最常见的支原体类型。


产品规格




参考资料

[1] https://pdb101.rcsb.org/sci-art/goodsell-gallery/mycoplasma-mycoides

[2] Uphoff CC, Drexler HG. Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures. Curr Protoc Mol Biol. 2014. doi: 10.1002/0471142727.mb2804s106.