RNA机制研究秘籍：分子互作技术解析DNA-RNA-蛋白调控通路！

生信分析虽可描绘分子调控网络，却如雾里看花，唯有结合核心分子互作研究技术，方可精准解析DNA-RNA-蛋白的互作网络，实证RNA从表达调控到功能执行的完整通路。那么，核心分子互作技术如何贯穿应用于RNA机制研究全流程？

四大核心分子互作研究技术

ChIP-qPCR分析

● 转录调控因子与目标基因互作，分析结合动态变化的因素（如竞争性抑制剂的存在、转录调控因子突变、目标基因突变）；

● 目标基因上转录复合物（如RNA聚合酶Ⅱ）的结合，发现新的调控机制，验证转录调控机制；

● 目标基因组蛋白修饰（如甲基化、乙酰化），揭示组蛋白修饰与基因表达的关联。

Co-IP-WB分析：转录调控因子与其它蛋白之间的互作；转录调控因子的蛋白修饰（如泛素化、磷酸化）。

RIP-qPCR：研究剪接相关蛋白与目标RNA前体的结合，分析剪接复合体的调控因素（如竞争性抑制剂的存在、剪接复合体突变）。

Co-IP：研究剪接复合体蛋白之间的互作。

RNA pulldown-WB/MS：筛选目标RNA结合的RNA降解/稳定性调控相关蛋白。

Co-IP：研究RNA降解相关蛋白与其它调控因子的互作。

RIP-qPCR/seq验证：

● 降解相关蛋白（如Ago2）结合目标RNA，同时分析其它ncRNA调控因子（如miRNA）对目标RNA降解的影响。

●m⁶A甲基化相关蛋白（如Writer、Eraser、Reader）结合目标RNA，研究RNA m⁶A甲基化的调控机制。

主要研究内容：在胃癌（GC）中，转录因子EGR1促进TENM3-AS1转录，通过重编程脂肪酸代谢增强胃癌转移。^[1]

TENM3-AS1转录调控研究

研究通过生信分析RNA-seq和数据库结果，预测与GC和TENM3-AS1表达相关的转录因子（TF）EGR1。ENCODE数据库中ChIP测序结果显示在H1和Ishikawa细胞中，EGR1与TENM 3-AS1启动子结合（图1A-B），使用JASPR预测结合位点（图1C）。anti-EGR1 ChIP-qPCR进一步验证EGR 1可重复结合TENM3-AS1的启动子的所有预测位点（图1D）。最后双荧光素酶报告基因实验验证了EGFR1可以促进TENM3-AS1的转录。

图1 anti-EGR1 ChIP验证EGR1与TENM 3-AS1启动子的结合。

RNA pulldown-MS：分析目标RNA结合蛋白谱，筛选功能表型变化相关的关键蛋白。

RIP-qCPR：验证关键蛋白与目标RNA的互作。

Co-IP-MS：分析RBP互作蛋白谱，研究RBP与目标RNA结合的影响因素；

Co-IP-WB：分析RBP修饰。

RNA pulldown（标签法）-seq：分析目标RNA结合的miRNA。

Anti-Ago2 RIP：分析关键蛋白Ago2结合的RNA，验证miRNA和目标RNA/靶RNA的动态结合关系。

RNA pulldown（标签法）-seq：分析目标RNA结合的mRNA。

RNA pulldown-MS：分析目标RNA翻译调控蛋白。

Co-IP-WB/MS分析：

● 翻译调控蛋白的互作；

● 目标RNA编码多肽/蛋白的关键互作蛋白（信号通路、外泌体组装、细胞表型等相关蛋白），分析其对下游通路或表型相关蛋白的影响；

RNA pulldown-WB/MS：筛选目标RNA结合的转录调控因子；

RIP-qPCR：验证转录调控因子结合目标RNA；

Co-IP分析：转录调控因子互作蛋白；转录调控因子的蛋白修饰。

ChIP-qPCR分析：

● 目标RNA对转录因子结合靶DNA的影响。

● 目标RNA对RNA聚合酶结合靶DNA的影响，反映目标RNA调控靶基因转录。

主要研究内容：circHAS2通过作为miR-1244的分子海绵，并结合USP10以促进p53核输出和降解，从而激活CCNE2促进细胞增殖，并使结直肠癌对安洛替尼的反应增敏。^[2]

circHAS2的ceRNA机制验证

生信分析预测circHAS2与miR-1244的表达相关，anti-Ago2 RIP揭示与miR-1244 NC组相比，miR-1244 mimic组SW620细胞中，Ago2结合的circHAS2富集程度更高（图2）。然后双荧光素酶报告基因实验验证circHAS2通过ceRNA机制，抑制miR-1244，并上调CCNE2的表达。

图2 用RIP法检测特定处理的SW620细胞中circHAS2和Ago2的相对表达。

circHAS2调控转录机制验证

circHAS2 RNA pulldown-MS分析显示在SW620细胞中，circHAS2可能结合泛素特异性肽酶10（USP10）。circHAS2 RNA pulldown-WB（图3A-C）和anti-USP10 RIP-qPCR（图3D），进一步验证了USP10和circHAS2的直接相互作用。

图3 circHAS2与USP10蛋白相互作用验证。

前人研究显示USP10可结合p53可相互作用，因此研究利用anti-USP10和anti-p53 Co-IP-WB验证了USP10与p53的结合（图4左）；anti-USP10 Co-IP-WB研究显示过表达circHAS2，减弱了USP10与p53的结合（图4右）。

图4 Co-IP验证p53和USP10的结合，以及circHAS2对USP10和p53结合的影响。

 在转染Flag-USP10、circHAS2或HA-Ub及MG132处理的SW620细胞中，anti-HA Co-IP-WB证实了circHAS2过表达促进p53蛋白泛素化和降解，该过程这可由USP10逆转。

图5 Co-IP验证CircHAS2与USP10相互作用调节p53泛素化和表达水平。

此外，Co-IP-WB分析SW620细胞核与细胞质组分中p53的泛素化水平，验证circHAS2过表达增加了细胞质中的p53泛素化（图6）。最后验证了circHAS2促进p53的核输出，使其在细胞中泛素化和降解，从而下调p53靶基因p21的表达并上调CCNE2的表达。

图6 Co-IP实验证实circHAS2上调细胞质中p53泛素化。

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[1]Tang Y, et al. The EGR1-mediated lncRNA TENM3-AS1 potentiates gastric cancer metastasis via reprogramming fatty acid metabolism. Mol Cancer. 2025;24(1):165.

[2]Li H, et al. CircHAS2 activates CCNE2 to promote cell proliferation and sensitizes the response of colorectal cancer to anlotinib. Mol Cancer. 2024;23(1):59.