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关于RIP技术，你想知道的都在这儿 ↓ ↓ ↓（附实验操作视频）
蛋白-RNA互作
基因表达调控的核心环节
蛋白质和RNA可以通过精确的分子识别（基于特定序列和结构）进行相互作用，这种相互作用是动态且高度调控的，是基因表达调控网络的核心环节。
RNA结合蛋白（RBP）参与几乎所有涉及RNA的核心过程，包括RNA转录、加工、修饰、定位、稳定性、翻译、功能执行以及降解；同时RNA-蛋白互作也参与调控蛋白定位、功能执行、修饰及各类复合物的形成。
图1 ncRNA（非编码RNA）可通过作为蛋白支架、蛋白与其它分子结合的引导物、蛋白诱饵（竞争性结合蛋白），影响RBP与其它分子互作；或通过影响蛋白修饰相关复合体作用，调控RBP的翻译后修饰。[1]
图2 RBP调控ncRNA的功能，如稳定性、降解、协同转录调控、定位。[1]
图3 RBP与mRNA相互作用，调控mRNA翻译起始（如eIF4F复合物、IRP蛋白）、剪接（如EJC）、RNA修饰（如甲基化酶、去甲基化酶、甲基化阅读蛋白）。[2]
RIP技术
蛋白-RNA互作分析的重要手段
RIP（RNA免疫共沉淀）是分析细胞内蛋白与RNA相互作用最常用的技术之一，利用目标蛋白的抗体，沉淀目的蛋白及其结合的RNA，纯化后的RNA可进行RT-qPCR、Microarray或高通量测序分析。
RIP技术可用于探索目标蛋白结合的RNA，研究不同条件下蛋白-RNA互作情况，分析目标RNA是否涉及目标蛋白介导的相关生命过程。
吉赛RIP试剂盒
蛋白-RNA互作分析的必备利器
RIP技术涉及特定的试剂和多种缓冲液，因此要高效完成RIP实验，必备一款好用的试剂盒。吉赛生物RIP试剂盒，持续多年畅销，深受众多实验室青睐，经久信赖，口碑之选！
吉赛优势
①稳定可靠：体系稳定，捕获效率高，重复性高；
②成分完整：含RIP实验所需的全套试剂，包括阴性对照IgG及柱式RNA提取试剂；
③高效便捷：实验时长短至5 h；
④样本需求少：仅需1×107细胞或0.1 g组织；
⑤流程严谨：有详细的目的蛋白富集验证步骤。
吉赛RIP试剂盒操作流程
吉赛RIP试剂盒操作视频
以下总结了伙伴们在使用吉赛RIP试剂盒过程中的高频问题和解答，帮助大家轻松、高效、准确分析蛋白-RNA互作！
RIP实验准备相关Q&A
Q：RIP实验需要准备哪些仪器？
A：匀浆器（组织样本用，细胞样本忽略）、移液枪、涡旋器、低温离心机、冰盒、旋转培养器（可进行垂直圆周运动的）、磁力架（用于吸附溶液中的磁珠）。
Q：RIP试剂盒可以用几次？
A：一次标准的RIP实验含Input组、IP组（实验组）及IgG组（阴性对照），IgG组与IP组是平行的两个IP实验，均消耗1T试剂量。因此一次（一个样本）RIP实验要消耗2T试剂量，即吉赛RIP试剂盒12T可做6次标准的RIP实验（样本）；24T可做12次标准的RIP实验（样本）。
Q：RIP试剂盒能不能分析RNA修饰？
A：不可以，RIP试剂盒是用于分析蛋白和RNA的相互作用，不能用于分析RNA修饰（乙酰化、甲基化等）；但可以用于分析RNA修饰相关蛋白（如Writer、Eraser、Reader）与RNA的互作。
Q：RIP和m6A-RIP（MeRIP）有什么区别？RIP试剂盒可以用于MeRIP实验吗？
A：RIP和MeRIP原理和步骤均不相同，因此不建议RIP试剂盒用于MeRIP实验。
RIP利用抗体结合蛋白，下拉蛋白-RNA复合物，无需RNA预提取和片段化步骤。MeRIP利用anti-m6A抗体直接结合RNA上的m6A修饰并下拉RNA；MeRIP为提高下拉效率，通常需要先提取RNA；为确定具体修饰的片段，一般需要先将RNA片段化。
Q：想做miRNA-RNA互作验证，可以如何设计RIP实验？
A：如果想验证ceRNA机制，可以用anti-Ago2抗体进行RIP实验。
① 先在正常条件下进行RIP，验证Ago 2可结合目标RNA和miRNA，暗示目标miRNA和RNA与ceRNA机制有关；
② 然后过表达/抑制miRNA或靶mRNA，再进行anti-Ago2 RIP，检测RIP产物中富集的目标miRNA和RNA量是否随之变化。
③ 通过RNA pulldown（标签法）和荧光素酶报告基因实验可进一步验证miRNA-RNA的互作。
Q：RIP必须要用1×107细胞量吗？
A：推荐用1×107的细胞量，RIP理论上只下拉目标蛋白结合的RNA，产物RNA量较少，且RNA和蛋白内源性结合可能是暂时和少量的，如果细胞起始量少，下拉的目标产物会更少，影响下游分析。
Q：RIP抗体选择有什么要求？为什么要求IP和IgG抗体种属一致？
A：需选择IP级抗体，建议IP抗体和IgG抗体选择相同种属，如IP抗体是兔源，IgG也应选择兔源。IgG组是阴性对照也是同型对照，需与IP抗体同种属来源、同剂量、同亚型，以消除由于抗体非特异性结合而产生的背景信号。吉赛RIP试剂盒中提供了兔源的IgG，若需要需要其它种属的IgG也可以联系吉赛生物购买。
RIP试剂盒组分相关Q&A
Q：RIP试剂盒中各种Buffer的作用分别是什么？
A：Buffer A：用于细胞裂解；Buffer B：较弱的洗涤液；Buffer C：较强的洗涤液；Buffer D:磁珠封闭液；Buffer E：提取试剂；Buffer F：洗涤液1 ；Buffer G：洗涤液2。
Q：Buffer稀释和配置可以用常规的RNase free water吗？
A: 常规的DEPC水处理即可。
Q：RIP试剂盒的Buffer A和普通IP裂解液有什么区别？
A：RIP试剂盒用的裂解液是相对温和的，以免破坏细胞中蛋白和RNA的结合状态。
Q：RIP试剂盒中的裂解液能用针对膜蛋白的裂解液代替吗？
A：不能，膜蛋白裂解液作用效果较强，会破坏分子间的互作。吉赛RIP试剂盒不适用于膜蛋白的RIP。
Q：不小心把Buffer A和B放-20 ℃了，怎么办？
A：不影响Buffer使用，恢复正常温度储存即可。
Q：洗涤用的Buffer B和Buffer C能混用吗？
A：不建议混用，两者洗涤次数不一致。
Q：磁珠结团怎么处理？
A：实验前磁珠结团或分布不均匀，可采用涡旋打散，如果打不散可以采用低温超声2 min打散磁珠。实验中发现磁珠结团，可用移液枪吹打，或者涡旋；如果打不散，在抗原捕获过夜前可低温超声2 min打散磁珠。
Q：RIP试剂盒中提供的核酸吸附柱是一样的吗，为什么分开装呢？
A：吸附柱的滤芯是特异吸附核酸的，配合不同buffer处理可以特异性吸附DNA或者RNA，分开包装更方便按说明书操作。
RIP的蛋白产物分析相关Q&A
Q：WB分析RIP的蛋白产物，为什么Input、IP和IgG都有条带，且位置在约50 kDa处？
A：可能存在IP抗体的重链干扰；建议：① 选择不同种属的IP抗体和WB一抗，避免IP抗体的轻重链干扰；② 选择只与重链或轻链反应的二抗用于WB，如果目标蛋白分子量小于30 KDa，选择重链特异性二抗，以避免抗体轻链的干扰；如目标蛋白分子量大于30 KDa，选择轻链特异性二抗，以避免抗体重链的干扰。
Q：WB检测RIP的蛋白产物，结果异常，条带不符或无条带是为什么？
A：① 条带信号不足：样本量过多，裂解不充分，无法有效释放目的蛋白；样本量过少，蛋白含量过少，可增加或减少样本量；抗体用量不足，增加抗体用量。
②抗体未免疫沉淀到目的蛋白：检查是否使用正确的IP级抗体；用裂解物预检或取部分裂解物作为产物进行WB检测，验证抗体质量、裂解液裂解效果等；更换抗体。
③ 目的蛋白内源表达过低：增加样本量或过表达目的蛋白。
④ 蛋白降解：使用新鲜或冻存时间不长的样本，避免样本在常温放置过长时间；
⑤ 非特异性结合蛋白条带过多：减少孵育时间、增加洗涤次数。
RIP的RNA产物分析相关Q&A
Q：最后提取的RNA建议用多少水进行溶解？
A：一般建议用30 uL的水溶解，水过多会使RNA浓度太低，可能要浓缩后才能用于测序，会导致样本损失。
Q：Input组RNA含量高于IgG和IP组，能正常进行RNA产物等体积转录吗？
A：正常的，Input组是总RNA，含量较高；IP和IgG组是拉下来目标蛋白结合的RNA，含量较低。
Q：RIP产物检测不到RNA浓度，或者浓度很低，这是正常的吗？后续怎么做RT-qPCR？
A：RIP洗脱纯化的RNA产物量很少，基本上不足以直接准确测量出浓度。RIP产物RNA浓度通常Input组为50 ng/uL左右，IP组5-10 ng/uL左右。一般6 uL，正常进行逆转录。
Q：RIP-qPCR出不来结果或CT值都接近40，怎么办？
A：① 检查样本中目标蛋白和RNA的内源性表达量，若表达量较低，建议考虑过表达后再做RIP；
② 检查抗体是否IP级抗体及其特异性和活性；
③ 如果样本降解，建议重新准备样本和RIP实验，注意低温操作；
④ 可尝试加大起始细胞量，如加大到2×107或3×107细胞。
Q：RIP-qPCR结果IP和IgG组相差不大，这是什么原因呢？
A：① IP抗体失效：先WB验证RIP蛋白产物，确认IP组正常下拉目的蛋白，可正常富集蛋白结合的RNA；确认IgG组无下拉目的蛋白，不能富集蛋白结合的RNA。否则可能是抗体的问题，建议确认IP级抗体的特异性和活性。
②非特异性结合：若IP和IgG组均富集了相当量的目的RNA，可能存在非特异性结合，建议洗涤步骤采用较强的Buffer C，减少孵育时间，增加洗涤次数。
③ 在某些条件下目的蛋白与RNA不结合。
参考文献
[1]Yao ZT, et al. New insights into the interplay between long non-coding RNAs and RNA-binding proteins in cancer. Cancer Commun (Lond). 2022 Feb;42(2):117-140.
[2]Corley M, et al. How RNA-Binding Proteins Interact with RNA: Molecules and Mechanisms. Mol Cell. 2020 Apr 2;78(1):9-29.
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