高质量circRNA如何制备？关键工具酶贯穿体外合成每一步

RNA体外转录是circRNA制备的关键上游环节，主要以线性双链DNA为模板合成线性RNA前体。其转录效率、产物完整性及副产物水平，是影响后续环化效率和circRNA质量的重要因素。

产品货号：R0405；

用于线性RNA前体的高效体外转录合成。

产品特点：

• 底物兼容性好：兼容普通NTPs、修饰NTPs及特定加帽体系，可用于多类型RNA转录产物制备。

• 热稳定性强：在50℃条件下仍保持较好转录活性，有助于降低模板二级结构影响、减少dsRNA副产物形成，并为后续IVT-环化一体化体系优化提供探索空间。

• 转录产量高：具备优异的扩增效率与极高的产物回报率，可实现线性RNA前体的高密度合成，满足从科研到工业工艺放大的需求。

• 转录长度范围广：适用于300–5000 nt转录本合成，可覆盖多类circRNA应用场景对RNA前体长度的需求。

  
  

图1. 吉赛生物与竞品T7 RNA聚合酶在不同反应温度下的转录产量对比

图2. 在30 μL反应体系中投入1 μg DNA模板，可稳定合成250–300 μg RNA转录产物

图3. 吉赛生物T7 RNA聚合酶对不同长度RNA前体（300-5000 nt）的转录效果

产品货号：R0201、R0202；

产品特点：

• 稳定反应体系：减少PPi积累对Mg²⁺浓度和聚合酶活性的影响。

• 提升转录效率：促进IVT反应持续进行，提高线性RNA前体产量。

• 支持长片段转录：有助于提升长片段RNA转录的稳定性。

产品货号：R0101、R0102、R0103、R0104；

用于抑制RNase活性，保护RNA在体外转录、环化及纯化过程中的完整性。

产品特点：

• 抑制范围广：可抑制多种RNase活性，包括RNase A、RNase B和RNase C等。

• 稳定性好：采用重组鼠源RNase抑制剂，经大肠杆菌表达纯化获得；与人源RNase抑制剂相比，不含人源蛋白中两个对氧化敏感的半胱氨酸位点，具有更好的抗氧化稳定性。

• 抑制效果强：在相同反应体系下，对RNase A表现出较强的酶活抑制效果，有助于降低RNA降解风险，提高RNA产物完整性和得率。

  
  

图4. 相同反应体系下，吉赛生物GSPure® RNase Inhibitor Murine和同类竞品对比，显示出对RNase A酶活性更强的抑制效果

RNA环化是circRNA体外合成的核心步骤。具有5′-磷酸和3′-羟基的线性RNA前体，在连接酶或环化酶催化下形成共价闭合结构。针对不同的底物特征与环化策略，选择适配的工具酶是提高circRNA得率与完整性的关键。

产品货号：R0502；

用于催化单链RNA的分子内或分子间末端连接，适用于以单链直连为基础的circRNA体外合成体系。

产品特点：

• 高效催化连接：作为ATP依赖型RNA连接酶，可高效催化单链RNA（亦兼容单链DNA或单核苷酸）的5′-磷酸末端与3′-羟基末端发生分子间或分子内连接，形成共价磷酸二酯键。

• 环化得率高：在相同反应体系下表现出优良的催化效能。用于circRNA制备时，有助于显著提升环化产物的得率与结构完整性。

• 拓展应用广泛：除常规的circRNA单链末端连接外，该酶还可广泛应用于单链寡核苷酸合成、3′-OH末端同位素标记（如引入5′-[³²P]pCp）、tRNA特异性修饰及蛋白质非天然氨基酸引入等多种分子生物学场景。

  
  

图5. 在相同反应体系下，吉赛生物T4 RNA Ligase 1与竞品相比，具有相似的催化效果且连接效率更高

产品货号：R0503；

用于双链RNA末端或夹板（Splint）辅助的环化连接，是circRNA体外合成研究中广泛应用的高效连接酶。

产品特点：

• 高效催化双链缺口：作为ATP依赖型双链RNA连接酶（dsRNA Ligase），其对双链核酸中缺口（Nick）的连接活性远高于单链末端，具有极强的双链结构连接偏好性。

• 深度适配夹板策略：具备强大的底物兼容性，可作用于RNA双链、RNA/DNA杂合链或DNA双链。通过设计RNA前体二级结构或引入DNA/RNA夹板形成局部双链区，可大幅度提升环化反应效率。

• 高活性与低成本：在相同反应体系下表现出优异的连接效能，仅需1 U酶量即可观察到显著的连接效果，有助于大幅降低环化反应成本并提高circRNA的制备效率。

  
  

图6. 在相同反应体系下，吉赛生物T4 RNA Ligase 2与竞品相比，实际连接效率更高，本反应体系中，仅需1U即有明显的连接效果

产品货号：R0501；

用于催化单链核酸（ssRNA/ssDNA）分子内5′-磷酸与3′-羟基（3′-OH）的直接连接。该酶兼具优异的耐热性与高效的催化活性，适用于中短链circRNA及单链DNA环化模板的体外构建。

产品特点：

• 精准分子内环化：特异性催化单链RNA或DNA底物发生分子内闭合反应，反应严格依赖底物的5′-磷酸基团和3′-羟基末端。

• 深度适配中短链底物：可高效环化15–500 nt范围内的单链核酸底物，兼容circRNA合成以及下一代测序（NGS）、滚动循环扩增/转录（RCR/RCT）所需的环化模板构建。

• 高耐热与高转化率：具备优异的耐热特性。实验验证表明，在特定体系下短时间内可实现85%以上的单链前体向环状产物转化，大幅提升高质量产物得率。

  
  

图7. 在45℃反应体系下，吉赛生物ssRNA Cyclase表现出优异的环化催化效率，仅需60 min即可将85%以上的单链RNA前体转化为环状RNA

circRNA体外合成完成后，反应体系中通常残留未环化的线性RNA前体及截短副产物。高效去除这些线性杂质，并验证目标产物对外切核酸酶的耐受性，是circRNA纯化与质量控制的核心环节。

图8. RNase R消化RNA示意图

产品货号：R0300；R0301；R0302；

用于特异性消化线性RNA并验证circRNA的耐受性，是circRNA产物纯化与质量控制的核心工具酶。

产品特点：

• 原研专利与稳定产能：作为获中美专利授权的原研突变体，通过多维度结构优化显著提升了酶活与稳定性，且重组表达效率提高10–1000倍，保障了高质量产品的规模化稳定供应。

• 高效去除线性RNA：具备优异的线性RNA外切消化活性，可充分、快速降解体系中残留的线性前体及各类复杂杂质，显著提升circRNA产物纯度。

• 高度维持circRNA完整性：在强效清除线性杂质的同时，对目标circRNA表现出极高的特异性保护，充分满足circRNA高纯度制备与耐受性质控的应用需求。
  

图9. 吉赛生物RNase R具备高效的线性RNA清除能力。在37℃体系中（10 U酶量），仅需15 min即可充分消化2.5 μg Total RNA中的线性RNA成分，消化效能显著

图10. 吉赛生物RNase R清除特定线性RNA的效能评估。在37℃体系中（10 U酶量处理2.5 μg Total RNA）孵育30 min，经RT-qPCR检测证实，其对β-actin和FGFR2等线性RNA的消化表现相较于同类产品更为高效、稳定

图11. 目标circRNA对吉赛生物RNase R的耐受性评估。实验结果表明，处理后hsa_circFOXO3_002和hsa_circMTO1_001等circRNA的丰度基本保持不变，证实该酶在实现高纯度制备的同时，能极好地维持产物的结构完整性

注：数据计算以“RNase R+吉赛”组为对照，设定其相对丰度值为1。

吉赛IVT系列工具酶

——为circRNA创新疗法开发降本增效

从实验室的早期研发到产业化的工艺放大，高效、稳定的工具酶是实现circRNA高质量制备的核心保障。吉赛生物依托高性能、高纯度的系列工具酶产品，为您提供贯穿circRNA体外合成全流程的解决方案，助力加速circRNA创新疗法的开发与落地。