为什么同样是circRNA，实验结果却可能完全不同？

circRNA受到广泛关注，一个重要原因在于其天然的共价闭环结构。

由于缺少5′端和3′端，circRNA相比相应的线性RNA通常具有更好的稳定性，不易受到外切核酸酶降解，因此有望实现更持久的蛋白表达。正因如此，"是否成功形成闭环"长期以来一直被视为评价circRNA的重要指标。

然而，形成闭环，并不意味着获得了高质量的circRNA。

2018年，Wesselhoeft等在Nature Communications报道了一种基于工程化自剪接内含子的circRNA构建策略。研究者进一步采用HPLC结合不同酶处理策略对剪接反应产物进行纯化，并比较了不同处理样品的组成及蛋白表达水平。结果显示，不同纯化策略获得的circRNA样品在蛋白表达能力上存在明显差异，提示纯化策略同样会影响circRNA的功能表现^[1]。

因此，仅以"是否形成闭环"评价circRNA质量，已难以满足实际研发需求。

目前，RNase R耐受性仍是验证circRNA环状结构的重要依据，但并不能全面反映样品质量。一方面，部分具有复杂二级结构的线性RNA同样可能表现出一定的RNase R耐受性；另一方面，样品中还可能残留未环化前体、断裂RNA以及其他体外转录副产物。

因此，对于circRNA研发而言，除了确认是否成功形成闭环，还需要进一步关注：

• 环化连接位点是否准确；

• 完整circRNA占比是多少；

• 是否存在影响实验结果的工艺相关杂质；

• 不同批次之间是否具有良好的一致性。

这些因素共同决定了样品质量，也为后续实验和应用奠定了基础。

在很多实验中，研究人员首先关注RNA浓度是否一致。但对于circRNA而言，真正进入细胞并发挥作用的，是完整、纯净且具有预期功能的circRNA分子。如果样品中混入未环化RNA、降解片段或其他工艺副产物，即使加入相同剂量的RNA，有效circRNA的实际含量也可能存在差异。

2019年，Wesselhoeft等在Molecular Cell进一步研究了外源circRNA的免疫原性。研究发现，未经充分纯化的circRNA制剂更容易诱导先天免疫反应；而去除工艺相关杂质后，免疫刺激显著降低。作者据此认为，外源circRNA引起的免疫激活主要来源于样品中的杂质，而非circRNA环状结构本身^[2]。

图2. 不同纯化策略对circRNA蛋白表达、稳定性及先天免疫反应的影响^[2]。

这一发现进一步说明，影响circRNA实验表现的，不仅是RNA用量，更包括样品组成及杂质控制水平。当实验中出现蛋白表达下降、免疫激活或细胞状态异常时，原因未必来自目标circRNA本身，也可能与样品中的工艺相关杂质有关。

因此，在评价circRNA样品时，除了关注RNA浓度，还应结合样品纯度、组成以及潜在杂质进行综合分析。

circRNA的制备通常包括体外转录、环化、酶处理和纯化等多个步骤，每个环节都有可能引入不同类型的工艺相关杂质。目前，行业重点关注的主要包括以下几类。

未环化线性RNA

环化反应难以达到100%效率，因此样品中通常会残留一定比例的线性RNA。由于其稳定性和生物学特性与circRNA不同，残留比例的变化可能导致有效circRNA含量发生差异。

双链RNA（dsRNA）

dsRNA是RNA药物研发中重点关注的工艺相关杂质，可激活RIG-I、MDA5等先天免疫通路，抑制蛋白翻译并影响细胞功能。其主要产生于体外转录过程中，也可能在后续加工或样品处理过程中形成，因此一直是质量控制的重要对象。

其他工艺相关杂质

DNA模板残留、RNA降解片段、工艺相关蛋白、酶残留以及内毒素等，同样可能影响实验结果，因此也需要进行有效控制。

对于circRNA质量控制而言，关键不仅在于识别杂质，更在于明确杂质的来源，并评估其是否会对产品性能和后续实验产生影响。

近年来，研究者开始进一步关注工艺相关杂质对circRNA功能表现的影响。2025年，曹宇虹团队在Advanced Science发表的一项研究系统评估了circRNA制备过程中多类工艺相关杂质，包括dsRNA、来源于未环化RNA的5′三磷酸结构以及RNA水解片段等。研究发现，这些杂质可通过RNA感知通路诱导先天免疫反应，并进一步影响细胞功能。

在此基础上，研究团队建立了一套结合酶处理和纤维素过滤的纯化策略。优化后的circRNA免疫激活水平明显降低，在细胞重编程和CAR表达实验中表现出更好的功能活性^[3]。

图3. 优化后的circRNA在细胞重编程中表现出更好的功能活性^[3]。

这项研究进一步说明，质量控制不仅影响样品组成，也可能影响circRNA的功能表现。对于科研应用而言，仅确认circRNA序列和环状结构并不足够，还需要通过有效的杂质控制，尽可能减少工艺副产物对实验结果的干扰。

随着质量控制要求不断提高，一个更加现实的问题也随之出现：如何判断一份circRNA是否真正可靠？

随着circRNA研究和应用不断深入，单一指标已难以全面反映样品质量，建立更加规范、系统的质量评价体系也愈发受到关注。

2022年，Nature Methods发表Best practice standards for circular RNA research，围绕circRNA的鉴定、表达分析和功能验证等关键环节提出了最佳实践建议，强调通过规范、系统的研究流程，提高实验结果的可重复性及不同研究之间的数据可比性^[4]。

对于circRNA而言，质量评价不应局限于单一检测指标，而应结合分子身份、结构完整性、杂质水平及功能表现等多个维度进行综合评估。

图4. circRNA研究中常用的鉴定与验证方法^[4]。

身份是否正确？

首先，应确认获得的是目标circRNA，而非错误连接、异常剪接或其他非目标RNA。通常可结合反向剪接位点扩增、测序及酶切验证等方法进行确认。

结构是否完整？

形成闭环并不意味着结构完整。在制备和保存过程中，circRNA仍可能发生断裂或降解。因此，除确认成功环化外，还应进一步评估完整circRNA所占比例，尤其对于长片段circRNA更为重要。

杂质是否得到有效控制？

除未环化RNA和dsRNA外，DNA模板、RNA降解片段、工艺相关蛋白、酶残留及内毒素等，也可能影响后续实验。因此，质量评价不仅需要确认杂质是否存在，还应结合检测结果分析其来源及潜在影响。

检测结果是否具有解释力？

检测报告的价值不仅在于提供结果，更在于帮助研究人员理解样品质量。

例如，同样标注为"纯度95%"，如果检测原理、定量口径或目标组分不同，其结果未必具有可比性。相比单一检测数值，科研人员更需要了解检测依据，以及剩余组分是否可能对实验产生影响。

是否达到预期功能？

对于蛋白编码circRNA，最终仍需通过功能实验验证其应用性能，包括目标蛋白的表达水平、表达持续时间以及不同批次之间的一致性。理化检测能够回答产品"是什么"，而功能验证才能进一步说明产品"能做什么"。

例如，Nature Biotechnology的一项研究发现，不同载体拓扑结构、工程化UTR序列、IRES及其他结构元件的优化组合，可显著影响circRNA的蛋白表达效率^[5]。这也提示，评价一份circRNA，不应仅关注理化质量，还应结合功能验证进行综合评估。

目前，circRNA领域尚未形成覆盖所有技术路线和应用场景的统一质量标准，但更加透明、可追溯、可解释的质量评价，正逐渐成为行业发展的重要方向。

对于科研工作者而言，高质量的circRNA意味着更加可靠的实验材料，也有助于提高实验结果的稳定性和可重复性；对于药物研发而言，则能够帮助更早识别工艺风险，为后续CMC开发和产业化提供支持。

随着circRNA应用不断拓展，质量评价也正从关注单一检测指标，逐步发展为涵盖身份、结构、杂质和功能表现的综合评价。这不仅有助于提高科研数据的可信度，也将为circRNA技术的进一步转化应用提供更加坚实的支撑。

吉赛生物持续完善circRNA质量评价方法，关注检测结果的可解释性和可验证性，为科研和产业应用提供更加可靠的质量评价支持。

1.Wesselhoeft, R. A., Kowalski, P. S. & Anderson, D. G. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat. Commun. 9, 2629 (2018).

2.Wesselhoeft, R. A., Kowalski, P. S., Parker-Hale, F. C., Huang, Y., Bisaria, N. & Anderson, D. G. RNA circularization diminishes immunogenicity and can extend translation duration in vivo. Mol. Cell 74, 508–520.e4 (2019).

3.Cao, Y. et al. Mitigating cellular dysfunction through contaminant reduction in synthetic circRNA for high-efficiency mRNA-based cell reprogramming. Adv. Sci. 12, e2502189 (2025).

4.Nielsen, A. F. et al. Best practice standards for circular RNA research. Nat. Methods 19, 1208–1220 (2022).

5.Wesselhoeft, R. A. et al. Engineering circular RNA for enhanced protein production. Nat. Biotechnol. 41, 560–568 (2023).