circRNA如何兼顾稳定与高效翻译？circDesign将IRES结构完整性纳入序列优化

circDesign采用动态规划进行circRNA编码序列设计，同时考虑编码区、IRES区域和环化元件，并联合评估MFE、CAI和IRES结构偏离度。算法通过搜索同义密码子组合，减少IRES与其他区域之间的不利相互作用，并促进区域内有利二级结构的形成。

研究团队采用PIE环化体系的元件命名描述算法流程。对于每条候选序列，组装完整circRNA后计算IRES结构偏离度，并在MFE和CAI相近的候选序列中，选择IRES结构偏离度最低的序列。

图1｜circDesign 工作流程及生成序列的评估

在RABV-G circRNA设计中，研究团队采用CVB3 IRES，并利用circDesign从约3000条同义编码序列中筛选出CR1–CR6。与CR-Ther和CR-Novo相比，CR1–CR6的IRES结构偏离度降低约1.5–4.5倍。

以CR3为例，其在CAI相近的情况下具有更低的MFE，同时减少了CDS与IRES之间的跨区域相互作用。实验结果显示，CR1–CR6整体具有较高的环化效率，纯化后先天免疫刺激较低；此外，不同circRNA的凝胶迁移率与MFE具有一定相关性。

稳定性评价涵盖热力学特性、体外降解和细胞内降解三个层面。CR1–CR3的熔解温度高于参考序列，体外半衰期达到15.56–20.62 h，较CR-Novo和CR-Ther进一步延长。

在人骨骼肌细胞中，CR1和CR3同样表现出较长的细胞内半衰期。流式细胞术检测进一步表明，CR3具有较高的RABV-G表达水平，CR1–CR5的蛋白表达整体高于CR6和CR-Ther。

在递送体系评价中，研究团队采用脂质-聚合物复合物（LPP）递送circRNA，并以GFP和荧光素酶为报告基因，与相应的化学修饰线性mRNA进行比较。体外实验显示，CR-GFP的表达高于LR-GFP，且LPP对circRNA具有较好的核酸酶保护作用。

小鼠肌肉注射后，CR-FLuc的表达可持续约1周，而LR-FLuc约2天后降至背景水平；8天累计荧光素酶表达约为线性mRNA的5.3倍，支持LPP用于circRNA体内递送。

在制剂稳定性评价中，CR1–CR6及参考序列CR-Novo和CR-Ther均采用相同的LPP体系包封，各制剂的粒径和zeta电位相近。室温储存30天后，CR-Novo和CR-Ther出现约15%–20%的RNA损失，而CR1–CR5降解较少。

在Balb/c小鼠中进行两次肌肉免疫后，各组早期中和抗体水平均较低；加强免疫后，CR1–CR4的中和抗体水平进一步升高。第21天，CR3的pVNT分别达到CR-Ther和CR-Novo的3.5倍和2.4倍，并在第28天维持较高水平。

细胞免疫结果显示，CR1–CR4均可诱导RABV-G特异性T细胞应答，其中CR3表现较为突出，其IFN-γ ELISpot平均为280.1个斑点。进一步分析显示，CR3诱导的CD4⁺和CD8⁺ T细胞以IFN-γ、TNF-α和IL-2表达为主，而IL-4水平较低，呈现Th1偏向型免疫应答。

图2｜编码RABV-G的circRNA表征

为比较CR3与CR-Novo的翻译特征，研究团队结合二级结构预测、RNA-seq、Ribo-seq及多聚核糖体分析进行评价。结构预测显示，CR3的IRES结构保持较完整，而CR-Novo中存在较明显的IRES-CDS跨区域相互作用。

RNA-seq和Ribo-seq结果显示，CR3具有更高的RNA和核糖体足迹丰度，其翻译效率为233.7，约为CR-Novo（159.9）的1.5倍。CR3的核糖体足迹在CDS区域分布也更为均匀。进一步的多聚核糖体分析显示，CR3具有更高的核糖体加载水平，与其较高的翻译效率一致。

为进一步比较CR3与CR-Novo的体内稳定性，研究团队对LPP包封后的circRNA进行肌肉注射。两种circRNA主要分布于注射部位，并可在脾脏和淋巴结中检测到。注射后24、48和72 h，CR3的肌肉保留比例分别为88.5%、70.0%和29.4%，高于CR-Novo的74.5%、25.4%和7.4%，支持CR3具有更高的体内稳定性。

长期免疫评价显示，第35、90和163天，CR3组pVNT分别为CR-Novo组的1.7、2.1和3.2倍。第163天再次加强免疫后，第170和177天进一步达到CR-Novo组的4.6和3.9倍。此外，ELISpot结果显示，CR3诱导了更强的抗原特异性IFN-γ和TNF-α反应，表明其能够维持较强的体液和细胞免疫应答。

图3｜CR3与CR-Novo翻译效率的比较

为尽量排除MFE和CAI差异的影响，研究团队以CR3为参照，设计了一系列MFE和CAI相近、但IRES结构偏离度不同的circRNA。结果显示，IRES结构偏离度最低的CR3具有最高的蛋白表达，其IRES以区域内配对为主；随着结构偏离度增加，跨区域相互作用增多，蛋白表达相应下降。

随后，在CDS与间隔序列连接处引入与不同IRES功能区域互补的30 nt序列，对IRES进行定向扰动，并设置非互补对照CR3-opti。CR3-opti具有更低的IRES结构偏离度和最高的蛋白表达，而IRES受扰动的构建体均出现不同程度的表达下降。

体外降解和多聚核糖体分析进一步表明，IRES结构扰动与circRNA稳定性下降及核糖体加载改变相关。此外，在EV71 IRES驱动的VEGF-A circRNA体系中，circDesign生成序列的VEGF-A表达高于参考序列，进一步支持该方法在不同编码序列和IRES元件中的潜在适用性。

图4｜IRES结构偏离对circRNA性能影响的研究

本研究开发了面向蛋白编码circRNA的序列设计算法 circDesign，在联合优化MFE和CAI的同时，引入 IRES结构偏离度 评估IRES结构完整性，从而将IRES结构状态显式纳入circRNA序列设计。

IRES结构完整性是影响circRNA翻译性能和稳定性的重要因素。因此，蛋白编码circRNA的序列优化除考虑密码子适应性和整体热力学稳定性外，还应关注完整circRNA背景下IRES与其他功能区域之间的结构相互作用。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.4782087