RNA与蛋白如何“对话”？一文梳理RNA-蛋白互作研究技术

RIP（RNA Immunoprecipitation，RNA免疫沉淀）是研究RNA-蛋白互作的经典技术，通过特异性抗体富集目标RNA结合蛋白（RBP）及其相关RNA，再对富集的RNA进行分析。

其中，RIP-qPCR适用于候选RNA的富集验证，而RIP-seq结合高通量测序，可在转录组范围内筛选与目标蛋白关联的RNA。

2025年，Guo等^[1]利用RIP-seq筛选与RNA结合蛋白IGF2BP2相关的circRNA，鉴定出circRNA-BISC。后续研究发现，BISC可与IGF2BP2结合，并通过影响其介导的c-MYC翻译参与三阴性乳腺癌BET抑制剂耐药调控。这一研究也体现了RIP-seq在从特定RBP出发筛选潜在互作circRNA，并进一步开展功能机制研究中的应用价值。

需要注意的是，RIP检测到的RNA富集并不一定代表RNA与目标蛋白直接结合，也难以精确定位具体的结合位点。

CLIP（Cross-linking Immunoprecipitation，交联免疫沉淀）是在RIP基础上发展起来的RNA-蛋白互作研究技术，通过紫外线交联固定直接接触的RNA与蛋白，再结合免疫沉淀和测序，鉴定RNA结合蛋白的靶RNA及其结合区域。

2003年，Ule等^[2]利用CLIP研究小鼠脑组织中的Nova-RNA互作，鉴定出34条被多次检出的靶转录本，其中约3/4编码与神经元突触功能相关的蛋白，进一步揭示了Nova参与神经元RNA剪接调控的作用。

随着测序技术和实验流程的改进，CLIP逐渐发展出多个技术分支：

• HITS-CLIP： 将CLIP与高通量测序结合，实现转录组范围内的RBP结合区域分析。

• PAR-CLIP： 引入光敏核糖核苷类似物，并利用交联产生的特征性碱基转换辅助识别结合位点。

• iCLIP： 利用交联位点引起的逆转录终止信息，提高结合位点的定位精度。

• eCLIP： 优化文库构建流程并引入匹配的输入对照，提高结合位点鉴定的特异性和可靠性。

  
  

不同CLIP技术路线比较[3]

与RIP和CLIP从蛋白出发寻找RNA不同，RNA pull-down以目标RNA为诱饵，用于筛选其互作蛋白。

实验通常通过体外转录制备生物素标记的RNA，与细胞裂解液孵育后，利用链霉亲和素磁珠富集相关蛋白，再通过Western blot或质谱进行鉴定。

该技术常用于lncRNA、circRNA等功能性RNA的互作研究。2010年，Tsai等^[4]利用RNA pull-down等实验发现，HOTAIR的不同区域可分别与PRC2和LSD1/CoREST/REST复合物相互作用，为揭示lncRNA参与表观遗传调控的机制提供了重要线索。

由于实验通常在体外进行，RNA pull-down获得的候选蛋白仍需进一步验证，不能直接认定其在细胞内与目标RNA存在天然的直接结合。

与传统RNA pull-down通常使用体外制备的RNA不同，ChIRP-MS和RAP-MS利用互补的核酸探针，在细胞样本中捕获内源RNA及其相关蛋白，再结合质谱进行鉴定。

ChIRP-MS（Chromatin Isolation by RNA Purification coupled with Mass Spectrometry）通常采用化学交联保留RNA相关蛋白复合物，并通过质谱分析其蛋白组成。

RAP-MS（RNA Antisense Purification coupled with Mass Spectrometry）的经典方案则结合紫外线交联与严格的变性洗涤条件，更侧重于鉴定与RNA直接接触的蛋白。

2015年，McHugh等^[5]利用RAP-MS鉴定出SHARP、SAF-A和LBR等Xist互作蛋白，并进一步发现SHARP通过HDAC3相关通路参与X染色体的转录沉默，揭示了Xist介导基因沉默的重要机制。

传统RNA-蛋白互作研究依赖复合物的富集与纯化，部分弱互作或瞬时互作可能在这一过程中丢失。邻近标记技术则通过将生物素连接酶等标记模块定位至目标RNA附近，在活细胞内标记邻近蛋白，再通过亲和富集和质谱进行鉴定。

RaPID利用BoxB/λN RNA识别系统将标记酶招募至特定RNA附近；CARPID则结合dCasRx RNA靶向系统，无需引入额外的RNA识别序列，即可分析内源RNA的邻近蛋白。

2020年，Yi等^[6]利用CARPID研究lncRNA XIST，除已知互作蛋白外，还鉴定出多个此前未被报道的候选蛋白，拓展了对XIST相关蛋白网络的认识。不过，这些候选蛋白是否与XIST直接结合，仍需进一步验证。

CARPID在活细胞中鉴定XIST邻近蛋白^[6]

不同于传统的RNA-蛋白复合物富集方法，TRIBE和STAMP通过RNA编辑酶在目标RNA上留下可被测序识别的编辑信号，从而鉴定RNA结合蛋白的潜在靶RNA。

2016年，McMahon等^[7]提出TRIBE（Targets of RNA-binding proteins Identified By Editing），通过将RBP与ADAR编辑酶催化结构域融合，在其邻近RNA上产生A-to-I编辑。研究人员利用该方法鉴定了果蝇特定神经元中的RBP靶RNA，展示了其在少量细胞中开展互作研究的潜力。

2021年，Brannan等^[8]提出STAMP（Surveying Targets by APOBEC-Mediated Profiling），采用类似策略，但利用APOBEC1介导C-to-U编辑，并可结合单细胞RNA测序，分析不同细胞中的RBP靶RNA。

近年来，RNA-蛋白互作研究进一步向内源RBP分析和活细胞动态监测等方向拓展，MAPIT-seq与POND-seq分别提供了不同的技术思路。

2025年，Cheng等^[10]报道了MAPIT-seq，通过抗体将RNA编辑酶定位至内源RBP附近，利用编辑信号识别其相关RNA，无需构建RBP融合蛋白。该技术还能同步获取基因表达信息，其单细胞版本scMAPIT-seq可用于分析不同细胞状态下的RBP-RNA关联。

2026年，Hu等^[11]报道了POND-seq，通过将RBP与可分泌的工程化蛋白纳米笼融合，使其相关RNA被包装并释放至细胞外，再从培养上清中回收测序。该技术可用于监测胞质RBP-RNA互作，研究人员利用其追踪了细胞应激条件下RBP相关RNA的动态变化，实现了对同一细胞群体的重复取样和纵向监测。

POND-seq技术原理^[11]

从互作分子的筛选、结合位点的解析，到活细胞中的动态监测，RNA-蛋白互作研究已形成多种互补的技术路径。但互作关系的发现只是机制研究的起点，后续还需要结合基因表达、蛋白水平及翻译调控等信息，进一步判断这些互作在具体生物学过程中的作用。

吉赛生物提供RIP、RNA pull-down、转录组测序、蛋白质组学、翻译组学及多组学联合分析等技术服务，为RNA-蛋白互作的筛选、验证及功能机制研究提供支持。