RNA pull-down探针法还是标签法？一文解决选择困难~

① 制备探针：通过体外转录或化学合成制备生物素标记RNA探针，以模拟目标RNA分子。

② 裂解细胞：处理样本，得到细胞裂解液。

③ 磁珠偶联探针：利用链霉亲和素磁珠特异性捕获探针；

④ 捕获RBP：将磁珠-探针与细胞裂解液孵育，使探针捕获相关的RBP。

⑤ 分析产物：纯化产物，进行WB或质谱分析。

图1 RNA pull-down探针法原理

图2 RNA pull-down探针法实验流程

① 操作便捷：利用探针直接捕获细胞裂解液中的RBP，实验流程简单，效率高；

② 条件灵活可控：体外实验，影响因素和实验条件可控，实验风险低。

③ 探针设计灵活性高：可采用序列全长探针，也可设计截短或突变探针，研究RBP的具体结合片段或位点；不仅限线性的lncRNA和mRNA，还可通过探针序列设计应用于circRNA；

④ 适用范围广：不依赖于目标RNA本底表达量，对细胞内表达丰度低的RNA同样适用。

论文：circCDK13-loaded small extracellular vesicles accelerate healing in preclinical diabetic wound models

影响因子：15.7

研究内容：负载circCDK13的小细胞外囊泡促进临床前糖尿病创面愈合

为阐明circCDK13促进人皮肤成纤维细胞（HDFS）和人表皮角质形成细胞（HEKS）增殖和迁移的分子机制，研究进行了RNA pull-down（探针法）及银染和LC-MS/MS分析，实验结果联合catRAPID omics v2.0预测数据，筛选出IGF2BP3是可能与circCDK13相互作用的候选特异性RBP（图3b-d）。

进一步利用RNAfold（图3e）预测了具有最小自由能（MFE）的circCDK13二级结构；NPDock预测circCDK13和IGF2BP3的物理相互作用（图3f）。然后再进行RNA pull-down（探针法）-WB和RIP-qPCR，证实circCDK13与IGF2BP3之间的结合（图3g−i）。随后对预测的circCDK13结合位点和IGF2BP3结构域进行突变，进一步利用RIP和RNA pull-down技术分析了两者互作位点（图3k-o）。

研究应用了吉赛生物提供的RNA pull-down（探针法）试剂盒及RIP试剂盒。

图3 a：RNA pull-down试验示意图；b：RNA pull-down产物银染；c：RNA pull-down产物LC-MS/MS分析结果；d：LC-MS/MS分析与catRAPID omics v2.0预测韦恩图；e：CDK13的最小自由能（MFE，红色）、热力学系综（绿色）和结构质心（蓝色）；f：NPDock图形表示circCDK13和IGF2BP3蛋白的分子对接；g：RNA pull-down-WB实验证实circCDK13与IGF2BP3互作；h-i：RIP实验证实circCDK13与IGF2BP3互作；j：FISH和IF显示CDK13（红色）和IGFB2P3（绿色）共定位；k：RNA pull-dwon-WB证实IGF2BP3的KH结构域与CDK13结合；l：CatPAPID算法预测circCKD13-IGF2BP3互作功能结构域；m：RIP分析KH结构域突变对circCDK13富集度的影响；n：MeRIP分析METTL3/14干扰对CDK13的m6A修饰的影响；o：RNA pull-down-WB检测CDK13突变及METTL3/14干扰对IGF2BP3互作的影响。

RNA pull-down标签法原理基于MS2-CP系统。MS2适配体源自MS2噬菌体，是一段可形成发卡结构的RNA，可与噬菌体MS2外壳蛋白（CP）结合，且结合具有高度特异性和亲和力。

① 构建MS2-RNA载体：以MS2适配体RNA序列作为标签，插入到目标RNA中合适的位置，根据MS2-目标RNA序列构建表达载体；

② 构建CP蛋白载体：构建CP蛋白（带Flag标签）表达载体；

③ 共转染载体：将MS2-RNA表达载体和CP蛋白表达载体共转染到细胞中；

④ 形成复合物：在细胞中，MS2-目标RNA和CP蛋白表达后，目标RNA自然结合相应的RBP和RNA（如miRNA），CP-Flag蛋白结合MS2适配体。

⑤ 捕获复合物：然后裂解细胞，利用Flag抗体下拉CP-Flag-MS2-目标RNA-RBP/RNA复合物，对产物进行提取和纯化，即可得到目标RNA结合的RBP和RNA。

⑥ 分析产物：可分别对蛋白产物可进行WB、质谱；RNA产物可进行RT-qPCR、高通量测序分析。

图4 RNA pull-down标签法原理（以circRNA为例）

图5 RNA pull-down标签法操作流程

① 内源结合状态：RNA-蛋白复合物在细胞内生理状态下形成，更能反映真实的互作状态；允许对细胞进行不同处理，研究在不同条件下，目标RNA和蛋白或RNA的结合状态变化；

② 特异性更高：蛋白与RNA在体内的互作亲和力和特异性可能强于体外探针；

③ 适用范围广：可同时研究目标RNA结合的蛋白和RNA；不依赖于目标RNA本底表达量，对细胞内表达丰度低的RNA同样适用。

论文：Exosome-derived circUPF2 enhances resistance to targeted therapy by redeploying ferroptosis sensitivity in hepatocellular carcinoma

影响因子：12.6

研究内容：外泌体来源的circUPF2通过重新调控铁肝细胞癌的死亡敏感性，增强对靶向治疗的耐药性

研究利用RNA pull-down（标签法）和质谱分析鉴定了circUPF2的RBP，并进一步用RIP、RNA pull-down（标签法）-WB/qPCR等实验验证circUPF2、IGF2BP2蛋白和SLC7A11 mRNA之间的相互作用。

研究应用了吉赛生物提供的RNA pull-down（探针法）载体及质谱分析服务。

图6 A：RNA pull-down（标签法）联合质谱分析筛选肝癌细胞中circUPF2的RBP。B：RIP证实IGF2BP2是circUPF2的RBP。C：RNA pull-down-WB进一步证实circUPF2和IGF2BP2互作。

图7 Sequence BLAST分析表明，circUPF2直接靶向具有较高AU含量的SLC7A11 mRNA的3’UTR。RNA pull-down检测circUPF2（Mut）和circUPF2（Wt）的MS2-CP pull-down效率，并用qRT-PCR检测MS2-circUPF2富集SLC7A11 mRNA的相对丰度。

总之，探针法流程简便快捷，成功率高，对“新手”友好；而标签法步骤较复杂、操作难度较大，但可以反映复合物天然结合状态，还可以分析蛋白和RNA。

无论您选择RNA pulldown探针法还是标签法，吉赛生物都可以提供相应的产品或服务，全面满足您的科研需求！